“强强联手”——生物惰性液相与多角度光散射检测器联用，助力双抗分子量准确测定

双特异性抗体（简称“双抗”）是一种新型的抗体药物，它可以同时发挥两种单抗联用的协同作用，临床价值很高，但其质量控制的要求也非常严格。在双抗研发生产过程中，需要对双抗分子的大小异质性进行测定，以确认双抗的连接情况，保障产品质量。

然而双抗分子量的测定条件中不仅需要使用高浓度的盐进行洗脱，而且紫外检测器无法直接得到分子量，这对常规液相系统管路的耐腐蚀性及检测器提出了挑战。

本文采用岛津生物惰性液相色谱仪Nexera XS inert搭配多角度光散射检测器（MALS）测定双抗分子量，为推断双抗连接情况提供分析依据。

流动相A：50mM磷酸盐缓冲液+300mM NaCl（pH=6.8）

流动相B：乙腈

检测器1：二极管阵列检测器SPD-M40A

检测器2：多角度光散射检测器MALS

样品制备条件及其他分析条件略

MALS需要通过测定已知分子量的标准溶液得到仪器响应常数，图1是牛血清蛋白标准溶液(66500Da)色谱图，计算得到MALS响应强度为2.9626×10^-7，SPD-M40A响应强度为8.8552×10⁵。

图 2为双抗样品色谱图，该样品为单抗Fc端融合型双抗，双抗样品检出3个主要色谱峰，计算得到峰1、峰2、峰3重均分子量Mw分别为197708Da、145121Da、56401Da，三峰重均分子量与数均分子量的比值（Mw/Mn）均为1.00，峰2与峰3分子量之和201522Da，与峰1分子量偏差为1.92%，因此推测出：

峰1为双抗（单抗Fc端融合scFv）

峰2为单抗（未融合scFv）

峰3为单链抗体scFv。

双抗分子量测定信息见表1。

图1 牛血清蛋白标准溶液色谱图

图2 双抗样品色谱图

表1 双抗样品分子量分布

本文通过体积排阻色谱法（SEC）联合多角度光散射检测器（MALS）对单抗Fc端融合型对称分子样品大小异质性进行分析，SEC根据分子量大小分离双抗样品，MALS检测器测定双抗样品分子量，从而推断双抗样品连接情况。此方法简单高效、准确度高，可用于测定双抗样品分子量。

Nexera XS inert生物惰性系统将 UHPLC 系统的高压耐受性与完全惰性的样品流路完美结合，确保没有金属表面的吸附作用，且具有高耐腐蚀性，从而为生物分子的分离提供了理想的解决方案。

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