司小令大讲堂第三季第六期丨关于内标法

司小令大讲堂第三季《HPLC日常分析中的注意事项之二》，继续分享液相色谱的使用知识。

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第三季第五期答题获奖名单

姓名

曾老师（浙江）

李老师（北京）

郑老师（浙江）

朱老师（浙江）

冯老师（广西）

手机

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恭喜以上五位老师，礼品将于本周寄出。

第六期

关于内标法

shimadzu

绝对校准曲线法在HPLC分析中的定量分析中广泛使用，但有时也会出现一些误差。特别需要注意的是，绝对校准曲线法中标准溶液和样品溶液的进样量必须保持高度一致，即便是极微小的变化也会产生误差。

为了消除这种误差，可在标准溶液和样品溶液中添加已知量的内标物质（I.S.），通过得到内标物与目标样品峰响应的比值来对目标样品进行定量。这种定量方法被称作内标法，由于是相对法，除了可以修正上面提到的进样量带来的影响外，还不容易受到测定条件变化对分析值的影响。例如流动相输液量的变动，光源灯能量的降低，样品溶液的蒸发，流动相组成的变化等影响。此外更重要的是，内标法还可减少样品前处理时产生的误差 (回收率的误差)。

内标物质（l.S.）有的时候很难选择，其必须满足下列条件。

① 必须完全溶于样品中，并与样品中各成分的峰能够完全分离

② 样品中不存在的纯物质

③ 色谱峰的位置接近目标成分的色谱峰位置

④ 与目标成分的化学结构类似

⑤ 化学性能上稳定，容易取得

*以上④只在修正进样量为目的时需要。

下面以内标法的实际应用来进行说明。此应用分析血清中的茶碱（药物），使用乙羟茶碱作为内标物质（l.S.）。

首先，配制数个浓度不同的茶碱标准溶液（例10, 20, 30, 40μg/mL），另外准备乙羟茶碱溶液作为I.S.溶液（20μg/mL）。各浓度的茶碱标准溶液 1mL与I.S.溶液0.5mL混合后分别进样，进样量10μL，则分别得到茶碱与内标物质的峰面积比（图1）。用所得的数据制作如图2的校准曲线。横轴为浓度比（Cx/Cs, x:茶碱/s:乙羟茶碱），纵轴为峰面积比 (Ax/As)。由于血清中也添加同样的内标l.S.溶液， Cs值一定，在横轴上取相应茶碱的浓度 (图2中Cx)。

接下来，将血清 1mL 与先前的I.S.溶液0.5mL混合。离心分离后，上清液进样10μL, 由所得的色谱图（图3) 求出茶碱与I.S.的面积比。当这个比值是0.75时，从图2中可定量血清中茶碱浓度为15μg/mL。