岛津成像质谱显微镜应用专题丨中药分析

枸杞子不同生长期内源性分子空间分布的质谱成像分析

自古以来，中草药就是人民防病治病的主要武器，对中华民族的繁衍昌盛发挥了重要作用。枸杞子作为我国传统名贵中药材，具有滋肝补肾、益精明目的功效。目前，枸杞子作为中药材和功能食品在全世界广泛使用，也是西北各省的重要经济作物。在枸杞果实成熟过程中，它产生的内源性分子构成了复杂的空间代谢网络，这些内源性代谢物在植物的抗病防御反应及信号传递中发挥着重要作用，更为重要的是它们也是天然药物的重要来源。因此，揭示药用植物不同生长阶段中次生代谢产物的组织分布特征及其累积规律,对其次生代谢产物合成研究以及调控、优化栽培生产技术、培育和保护优良种质资源等方面都有重要意义。

质谱成像技术是近年来受到关注的一种新型的分子成像技术。基于高灵敏、高分辨、高通量特性的质谱结合先进的显微成像技术，样品制备过程不需要组织粉碎，无需标记即可实现多种物质在组织中的原位分布,为多种代谢物的研究提供了更多的信息维度。在本研究中，我们使用质谱成像技术建立了一种简单、可靠的方法直接可视化枸杞果实组织中内源性分子的空间分布特征，为进一步了解枸杞果实生长过程中内源性分子的生理作用提供了一种空间可视化方式，同时突出了质谱成像作为一种可行性工具在药用植物领域的应用潜力。本研究实验思路见图1。

图1 利用质谱成像技术可视化枸杞果实中内源性分子分布

将冷冻新鲜枸杞果实包埋在10%的明胶中进行冷冻切片,切片厚度为30 μm , 将所得组织切片放置在 ITO 导电载玻片上（100 Ω/m2，日本大阪松浪玻璃），在装有干燥剂的 50 mL 离心管中干燥 20 分钟。使用基质升华设备iMLayer（Shimadzu，Kyoto，日本）将基质升华于组织切片表面，正离子模式使用2,5-二羟基苯甲酸（DHB），负离子模式使用9-氨基吖啶（9-AA）作为基质，然后对上述组织切片进行成像分析。质谱条件如下：正/负离子模式分别采集；采集质量范围：m/z 100-1000；激光直径 25 μm；激光强度25。

采集花后15d、28d、31d的枸杞果实作为研究样品，分别对应S1期（绿色）、S2期（黄绿色）和S3期（红色）。采用iMScope TRIO 成像质谱显微镜对三个不同生长期的枸杞果实进行了糖（己糖、蔗糖）、柠檬酸、生物碱（甜菜碱、胆碱）及多酚类内源性分子的空间分布分析。如图2所示，胆碱、甜菜碱和柠檬酸在所有生长期均匀分布在整个果实中。己糖分布于内果皮和果肉组织中，而蔗糖位于种子中。

图2  (a) S1 ~ S3时期枸杞果实的光学图像。(b-f)正离子模式：m/z 104.11（胆碱）、156.04（甜菜碱）、230.09（柠檬酸）、219.03（己糖）和381.08（蔗糖）的质谱成像图。

随着果实发育，柠檬酸的信号强度在减弱，而胆碱、甜菜碱、己糖和蔗糖的信号强度在增加。此外，如图3所示，随着果实成熟，三种酚酸和四种黄酮类化合物在外果皮中积累。有报道称，酚类化合物在植物抵御病原菌侵袭和紫外线照射方面发挥着重要的保护作用。这表明它们可能在枸杞果实生长过程中发挥了某种非生物和生物胁迫的保护作用，具体作用机制需要进一步研究。

图3  (a) S1 ~ S3时期枸杞果实的光学图像。(b-h)负离子模式：m/z 163.04（对香豆酸）、179.03（咖啡酸）、285.04（山奈酚）、301.03（槲皮素）、315.05（异鼠李素）、353.09（绿原酸）和463.09（异槲皮素）的质谱成像图。

本研究结果有助于更好的了解枸杞子不同成熟期生物活性物质的分布，为枸杞子成分识别、质量评价、高值化利用等提供参考。

本文相关内容由中国科学院兰州化学物理研究所的赵维花博士生提供，详细研究内容已正式发表于Talanta, 2021, 234: 122687。