蛋白质N端测序仪（PPSQ）之埃德曼降解

蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，蛋白质的氨基酸序列和它的立体结构构成了蛋白质结构的多样性。蛋白质具有一级、二级、三级和四级结构，蛋白质的结构决定了它的功能。

蛋白质的一级结构指的是氨基酸残基在蛋白质肽链上的排列顺序。每一种蛋白质都有唯一且确切的氨基酸序列。

采用岛津的蛋白质N端测序仪（PPSQ）可以测定蛋白的一级结构。

埃德曼降解是由埃德曼（P.Edman）在上世纪六十年代所创立并自动化。整个反应过程可分为：耦联、环化裂解、转化三个步骤。

1、耦联，即在碱性环境下，蛋白的N端与异硫氰酸苯酯（PITC）发生反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）衍生物。

2、环化裂解，即用酸处理，环化，使肽链N端被选择性的切断，得到N端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物（ATZ）。紧接着用有机试剂将ATZ氨基酸萃取下来，转移到转化仓。

3、转化，即在酸的作用下，ATZ-氨基酸不稳定，转化为稳定的苯基乙内酰硫脲（苯基海硫因）衍生物（PTH-AA），然后进行色谱分析。依据色谱的保留时间判断是哪一种氨基酸。剩余的肽链中酰胺键不受影响，进入下一个循环，继续发生降解。每发生一次反应，可鉴定一个位置的氨基酸。当全部结果测定结束后，即可得到全部的氨基酸序列结果。

1、可以准确分析N端氨基酸序列，特别是能辨别异亮氨酸和亮氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸；

2、灵敏度高；

3、可靠直接，和质谱法相比较不依赖于数据库。

1、 N端被封闭时，需要先除去这些基团，才能测序；

2、不能直接测试含二硫键的半胱氨酸的序列；

3、对于较大的蛋白，需要先切成较短肽链，再分别进行分析。

R1：异硫氰酸苯酯（PITC）与蛋白的N端反应耦联到氨基上，继而引发后续反应；

R2：分别为12%的三甲胺（等度）和N-甲基吗啉（梯度），为耦联反应提供碱性环境；

R3：三氟乙酸（TFA）为环化裂解反应提供酸性环境；

R4：分别为25%三氟乙酸水溶液（等度）和25%三氟乙酸水溶液（梯度），为转化反应提供酸性环境；

S2：乙酸乙酯，用于清洗多余的化学试剂及生成的副产物；

S3：1-氯丁烷，萃取剂，可将ATZ氨基酸萃取下来，运输到转化仓进行转化反应；

S4B：37%乙腈，溶解PTH-AA，进样。