说说理论板数那点事儿~
色谱柱的理论板数（n )用于评价色谱柱的分离效能，是评价色谱柱性能的参数之一，简称柱效。它取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效时所用物质的性质。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。
理论板数的计算公式如下：
在规定的色谱条件下，注人供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间tR 和峰宽（W ) 或半高峰宽(Wh/2) , 按n=16（tR/W）2或 n=5.54（tR/ Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。tR、W 、Wh/2可用时间或长度计，但应取相同单位。
当同一色谱柱，用相同洗脱条件的时候，不同化合物的保留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。因此理论塔板数大的色谱柱效率高。
对于等度洗脱系统，理论板数（N）为常量时，峰宽（W）或半高峰宽(Wh/2) ,随（tR）成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，化合物响应相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。也因此信噪比逐渐降低，含量测定的误差逐渐增大。
因此，为保证含量测定的可靠性，中国药典将理论板数作为色谱系统系统适用性的五个参数之一。
实际操作为例：
但在实际操作中发现：很多色谱条件不局限于等度系统，随着分析成分的复杂性，越来越多的色谱条件使用了梯度洗脱程序。而“在规定的色谱条件下”，我们只规定了流速、流动相种类、比例、梯度程序、柱箱温度、色谱柱类型、检测波长等条件。对仪器厂家、仪器的型号、混合器体积等等并未规定。而不同仪器厂家、同一厂家的不同型号的仪器、同一型号的仪器选择的低压梯度系统还是高压梯度系统、甚至这些都相同但使用不同体积的的混合器时，梯度延迟体积有很大的不同。
以中国药典2015版一部 962页，护肝胶囊的含量测定为例：
色谱条件与系统适用性试验用ACQUITY UPLC HSST3（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml，检测波长为250nm；柱温为40℃。理论板数按五味子乙素峰计算应不低于150000。
时间 (分钟) | 流动相 A（%） | 流动相 B（%） |
0-3 | 45 | 55 |
3-15 | 45→80 | 55→20 |
同一台仪器、同一根色谱柱、同样的流动相，按上述试验条件，当使用100UL混合器时五味子乙素保留时间13.5分钟，理论板数按五味子乙素峰计算只有11万左右；当使用500ul混合器时，五味子乙素保留时间14分钟，理论板数按五味子乙素峰计算只有14.8万左右；当使用900ul混合器时，五味子乙素保留时间15.7分钟，理论板数按五味子乙素峰计算有18.8万左右。当然再增大混合器体积，五味子乙素的保留时间会更大，理论板数也会更大。
也就是说：对于同一根色谱柱，当梯度洗脱的初始比例对待测化合物的洗脱能力很弱时，随着仪器梯度延迟体积的增大，保留时间tR逐渐延长，峰宽（W）或半高峰宽(Wh/2)基本不变，导致计算的该色谱柱理论板数随着仪器梯度延迟体积的增大而显著增大。这显然背离了我们将理论板数作为系统适应性试验参数的初衷。
依此建议：对于色谱条件是梯度洗脱系统的，在系统适应性实验中取消理论板数参数，或者在要求理论板数参数是，要规定梯度延迟体积。
温吉辉
■ 资深液相工程师
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