特色技术合作 | 在线超临界流体萃取-色谱质谱联用系统助力水产品中禁用物质快速检测

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岛津中国创新中心与张家口市食品药品检验中心合作，通过在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱仪Nexera UC（Online SFE-SFC-MS/MS），开发水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐性孔雀石绿、隐性结晶紫的测定方法，为Nexera UC在水产品自动化分析的应用提供了参考。

背景介绍

孔雀石绿（Malachite Green，MG）和结晶紫（Gentian violet，GV）均为人工合成的有机化合物,属于三苯甲烷型染料，同时也是杀菌和杀寄生虫的化学制剂，常用于鱼类水霉病等寄生虫病的防治，或作为消毒剂用于鲜活鱼类运输过程中，以延长鱼类的存活时间。孔雀石绿和结晶紫在生物体内分别代谢为隐性孔雀石绿和隐性结晶紫。这些化合物具有高残留、高毒性、高致畸和高致癌性，对人们的健康构成了潜在的巨大威胁，我国自2005年已将其列入禁用目录中。

孔雀石绿（Malachite Green，MG）

结晶紫（Gentian violet，GV）

目前国标中检测方法主要有高效液相色谱法、荧光色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等，但前处理方法繁琐。本方法采用在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法（Online SFE-SFC-MS/MS），对水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的残留量进行测定，样品只需简单粉碎后加入脱水剂即可直接上机，进行超临界流体萃取、经超临界流体色谱分离和质谱检测。与传统检验方法相比较，Online SFE-SFC-MS/MS法将以往样品前处理以及分析检测的数小时，缩短到现在全流程仅需要30分钟，该方法具有简单、快速、安全、准确等优点。

在线超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱仪Nexera UC

实验方法

（1）萃取条件：

萃取剂：A为超临界CO₂，B为含0.1%甲酸的甲醇。萃取剂比例：（95：5，V/V）。萃取流速：3 mL/ min。萃取温度：40℃。萃取时背压A为15 MPa，背压B为14.8 MPa。采取先静态萃取4 min，再动态萃取3 min的方式进行萃取。

（2）色谱条件：

色谱柱：Shim-pack UC-X RP C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)。

流动相：A为超临界CO₂，B为含0.1%甲酸的甲醇。流速：2 mL/ min。柱温：40℃。采用5%B (7 min)- 30%B(10-15 min)- 5%B(15.1-17 min)梯度洗脱程序。洗脱时背压A为15 MPa，背压B为40 MPa。

（3）质谱条件：

正离子检测模式；离子源：ESI源。离子源温度：400 ℃。脱溶剂管温度：200 ℃。加热模块温度：400 ℃。雾化气流量：3 L/min。加热气流量：15 L/min。干燥气流量：5 L/min。

结果与讨论

（1）线性和定量限

配制系列标准曲线工作液（10ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、60ng/mL、100 ng/mL、160 ng/mL、200 ng/mL），以超临界流体萃取专用空白滤纸片为基质，将混合标准溶液和内标溶液加在滤纸上，并放入5mL规格超临界流体萃取装置的萃取罐中，按照本试验选取的超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件进行测定。以峰面积为纵坐标，标准品质量（ng）为横坐标，进行线性回归，得到各组分的回归方程及相关系数，见表1。结果显示该方法在试验范围内线性关系良好。

表1 各组分线性关系测定结果

目标物质	工作曲线方程	R
孔雀石绿 MG	Y=1.05679X-0.0430716	0.9907
结晶紫 GV	Y=1.80035X-0.0698144	0.9918
隐性孔雀石绿LMG	Y=0.903847X+0.0133817	0.9993
隐性结晶紫 LGV	Y=16.4007X+0.0721813	0.9981

以空白虾肉样品为基质，称取1.0g，将标准品溶液和内标混合溶液加入空白基质，混匀后，进行测定，记录峰面积，在信噪比S/N约为10时测得最低检测浓度为0.5μg/kg，即定量限为0.5μg/kg。

图1 Online SFE-SFC-MS/MS分析水产品中孔雀石绿和结晶紫色谱图（0.5μg/kg）

（2）回收率与精密度

分别以空白虾肉和空白鱼肉基质，各称取1.0g，加入不同浓度水平的标准品溶液及内标混合液，按照本试验选取的超临界流体萃取-超临界流体色谱-串联质谱法检测条件提取测定，将峰面积代入回归方程计算加标回收率。结果在0.5ng/g～5ng/g的加标范围内，水产品中孔雀石绿、结晶紫、隐形孔雀石绿、隐性结晶紫的回收率范围分别为80.28%～108.21%、89.02%～110.46%、80.19%～110.36%、85.22%～109.38%，RSD值范围分别为5.3%～7.1%、4.9%～7.9%、5.2%～8.9%、5.7%～6.6%。