司小令大讲堂第三季第三期丨关于来自样品溶剂中溶解空气的峰
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第三期——关于来自样品溶剂中溶解空气的峰
在HPLC分析中，常常出现不明原因的峰(鬼峰)。特别是在药物杂质的研究分析中非常让人困扰。产生鬼峰的原因各种各样，但出乎意料的原因之一是由于样品溶剂中所溶解的空气。本文以反相分离检测中的例子来说明。
因溶解空气（氧气）出现的峰
样品溶液和流动相之间，如果有机溶剂的种类或组成不同，可预想到会出现一些干扰峰。但是，即使将流动相作为样品溶液进样时，也会出现峰，那么被保留并洗脱出来的峰“究竟是什么呢”？
其中原因之一，是溶解空气量的不同引起的，特别是在使用UV检测器时。
如图1所示，将甲醇/水混合溶液同时作为流动相和样品溶液使用，流动相经过在线脱气处理，而进样的样品溶液采取不同的处理方式：a）空气饱和（未处理）、b）氦气脱气、c）氧气吹扫，对比所溶解不同氧气量时的出峰情况。
图1 流动相作为样品溶剂进样时出现的峰（流动相在线脱气）
<分析条件>
样品溶剂：同流动相10μL，a）空气饱和、b）氦气脱气、c）氧气吹扫
色谱柱：STR ODS（4.6x150mm）
流动相：甲醇/水=85/15（在线脱气）
流量：1mL/min；温度：40℃；波长：210nm
样品溶剂在空气饱和状态下进样时，出现峰(图1a，注入10μL时约为10mAbs)，这个峰在样品溶剂用氦气脱气后（此时所溶解的氧气浓度几乎为零）进样时，几乎没有(图1b)。另外，经过氧气吹扫后(此时溶解氧气的浓度约为空气饱和时的5倍)明显增大(图1c)。
另一方面，若流动相未经在线脱气，样品溶剂在空气饱和情况下进样时，几乎看不到峰(图2a)，而在用氦脱气后可看到负峰(图2b)。
由此可见，流动相和样品溶液中会因溶解氧气量不同而出现不同的峰。
图2 流动相作为样品溶剂进样时出现的峰（流动相未脱气）
<分析条件>
流动相未脱气，其他分析条件与图1相同
峰的大小
再来看看这个峰的大小。图3是空气饱和(未脱气)的甲醇与脱气后的甲醇的光谱比较情况，可以看出甲醇经过脱气后吸光度变小，吸光变化根据波长而异，在210nm时为300mAbs以上，254nm时约为10mAbs。那么其他溶剂又怎样呢？如图4所示，不同溶剂在脱气前后光谱吸收的“差值”不同，“差值”等于“未脱气时”减去“脱气后”的吸光度值，其中水、乙腈受溶解空气的影响小，而正已烷，甲醇、THF则受到影响较大。
图3 甲醇脱气前后的光谱吸收情况
图4 不同溶剂在脱气前后的吸光度差值不同
水：纯水，乙腈/甲醇/ THF/正已烷：HPLC级
但是，吸光度变化量与不同溶剂溶解氧气能力的关系并不完全一致。例如，正已烷对氧气的溶剂能力要远远大于甲醇，但其吸光度变化反而更小。因此，吸光度的变化不仅仅是由于溶解的氧气，而是氧气与溶剂相互作用的结果。
峰的洗脱位置
通常被认为是溶解氧引起的峰，也许会觉得其洗脱较快。但是，如图5所示，流动相和样品溶剂的组成相同，“氧气峰”随着流动相中的甲醇比例下降而洗脱变慢，如此与样品成分保留行为相似。另外，使用磷酸缓冲液代替水时，显示出同样的倾向。如此，此峰有与目标成分峰重叠的可能性。
图5 流动相中甲醇比例对洗脱时间和峰面积的影响
<分析条件>
样品：流动相10μL，空气饱和
色谱柱：STR ODS (4.6x150mm)
流动相：甲醇/水：（经脱气）；
流量：1mL/min，温度：40℃，波长：210nm
如何检验可疑峰是空气峰？
在使用基于气液分离膜原理的在线脱气机时，如有可能来自溶解空气的可疑峰时，用如下的方法进行检验，如果相符，则其可能性很高。
1）多次进样相同体积的样品溶剂，出峰位置几乎相同。测试用空气饱和样品溶剂稀释后进样X倍的体积，得到约X倍的峰面积。为使样品溶液空气饱和，可选择搅拌（摇晃）或半开放放置样品。
2）将流动相（空气饱和）作为样品溶剂进样时，出现峰的洗脱时间与可疑峰的洗脱时间一致。这时，测试使用脱气后流动相进样时（氦气脱气10秒钟左右），峰会变小。
3）流动相未经脱气机时，将空气饱和的流动相作为样品溶剂进样，峰一定比2）时小。但是样品溶剂组成与流动相相差很大时峰不一定变小。
对策
完全消除溶解空气造成的鬼峰是很难的，但可考虑使其变小或者尽量避免和样品峰重合。
◆ 减小溶解空气造成的峰的方法包括（以流动相条件是甲醇/水为例）：
1） 甲醇改为乙腈。变更时要考虑洗脱能力和分离选择性。
→ 如允许变更条件，此法较好。
2） 降低流动相中的甲醇比例，重新选择适合新分析条件的色谱柱(保留弱的柱子，或比较短的柱子)。
→ 对分析人员的技术知识有一定挑战。
3）样品溶剂进样前脱气，只需用氦气脱气10秒左右，脱气效果好。
→ 操作较复杂，连续运转时难于达到预期效果。
4） 流动相停止在线脱气。
→ 停止后，可能因流路中产生气泡而发生故障，定量精度变差，得不到稳定的检测结果，不推荐使用此法。
◆ 另外，改进空气鬼峰与目标成分分离的方法包括：
1）目标成分为离子时，改变流动相的pH以调整目标成分的洗脱位置。
2）改变有机溶剂的种类。
如上所述，即使可判断鬼峰来自溶解空气，也会遇到无法解决的情况。但是如果充分了解原因和对策， 对分析条件的开发、调整优化等方面都会非常有帮助。
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【单选】关于溶解在样品溶剂中的空气（氧气）带来的峰，哪项是错误的
A：流动相和样品溶液中会因溶解氧气量不同而出现不同的峰
B: 不同溶剂受到溶解空气的影响不同，例如甲醇、THF到影响较大
C: 降低流动相中的甲醇比例，“氧气峰“的洗脱会变慢
D：溶解氧引起的峰，洗脱较快，不会对目标样品产生影响
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