大连化物所-岛津组学研究创新实验室系列（二）| 基于GC-MS代谢组学研究肝细胞癌的代谢重编程和风险分级

代谢重编程是癌症的标志之一，癌细胞经常通过代谢重编程来促进其自身生长、增殖、迁移和存活。由于肝细胞癌（HCC）存在高度异质性，很难采用单一或多个生物标志物全面反映HCC的预后特征^【1-3】。

中国科学院大连化学物理研究所生物分子高分辨分离分析及代谢组学研究组（1808组）许国旺研究员团队，基于GC-MS代谢组学研究策略，揭示了肿瘤组织代谢特征与HCC预后评估存在关联。通过特征代谢物作为HCC预后风险分级分类器，可以为HCC临床预后评估和个性化治疗提供指导。相关研究结果以“Metabolic Reprogramming and Risk Stratification of Hepatocellular Carcinoma Studied by Using Gas Chromatography–Mass Spectrometry-Based Metabolomics”为题，发表在《癌症》（Cancers）期刊（DOI: 10.3390/cancers14010231）^【4】。相关研究进展来自大连化学物理研究所·岛津组学研究创新实验室产生的合作成果。

肝细胞癌（简称“肝癌”）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国尤为高发，每年新发病例和死亡病例均占全球近一半。肝细胞癌（HCC）是目前最常见的一种肝癌，约占原发性肝癌的90%，通常见于肝硬化和慢性肝病患者^【5】。手术切除是HCC主要的根治性手段，但切除术后患者仍可能因复发率高、转移或基础肝病而死亡，严重影响患者的手术疗效和生存率，总体预后并不理想^【6】。

代谢重编程作为恶性肿瘤发展过程中的重要标志之一，直接参与肿瘤发生^【7】。代谢紊乱会影响组织的生物学行为，而组织的代谢重编程可以更好地反映器官的功能状态。基于组织样本的代谢组学研究是研究疾病代谢异常的有效策略，可提供有关代谢修饰和调节机制的信息，有助于阐明癌症的基本病理生理学，为临床治疗提供潜在的治疗靶点。

本研究采用气相色谱三重四极杆质谱法（GCMS-TQ8050 NX）的非靶向代谢组学研究策略（图1），对130例配对的肿瘤组织（HCC患者组织的肝细胞癌组织（HCT）和邻近非癌组织（ANT））进行了代谢轮廓分析。通过FDR（伪发现率）校正后，采用配对非参数检验（Wilcoxon检验）确认81种代谢物（HCT中21种上调，60种下调）为差异代谢物（FDR校正p<0.05）。通过可视化分析展示差异代谢物的变化趋势，并对其进行聚类分析（图2）。

结果表明，HCT组与ANT组在氨基酸、中心碳代谢相关代谢物、脂类、糖类、多元醇、有机酸、核苷酸、维生素等化合物方面存在显著差异。肿瘤依赖性丝氨酸和色氨酸水平在HCT组显著升高，且这两种物质已被报道成为肿瘤靶向治疗的治疗靶点。值得注意的是，所有检测到的糖类和大多数多元醇在肿瘤组织中的丰度较低，这可能与恶性肿瘤中葡萄糖代谢异常活跃和果糖代谢大大降低有关，说明了癌变对能量代谢的影响。此外，HCT组中次黄嘌呤呈上升趋势，而黄嘌呤则急剧下降，这与之前配对的HCC组织进行的代谢组学分析结果一致。

在 HCT 组观察到丙酮酸和乳酸（主要的糖酵解产物）水平升高，表明总体糖酵解通量增加。三羧酸循环（TCA）中的三种中间产物（琥珀酸、富马酸和苹果酸）明显减少，表明通过有氧磷酸化产生的三磷酸腺苷（ATP）水平较低。同时发现脂肪酸代谢在肿瘤代谢重编程中也发挥了关键作用。与多不饱和脂肪酸（MUFA）的升高相反，单不饱和脂肪酸（PUFA）的含量却明显降低，这可能表明去饱和途径受到了抑制，而β-氧化得到促进。次黄嘌呤在黄嘌呤氧化还原酶（XOR）的催化下氧化为黄嘌呤，随后转化为尿酸。次黄嘌呤的积累和下游代谢产物的减少可能与HCC中XOR的活性受到抑制从而阻碍了嘌呤的分解有关（图 3）。

图3  HCC代谢通路

采用非负矩阵分解（NMF）聚类方式（K=3），并对HCC代谢表型进行聚类分析（图4a）。经FDR校正后（p<0.05），在代谢表型中发现14种差异代谢物，其中6种脂肪酸（苜蓿酸、棕榈酸、棕榈油酸、肉豆蔻酸、油酸和棕榈酸）在肿瘤组织中的差异最为显著，且在代谢表型Ⅲ显著性差异最高。除了代谢特征的显著差异外，甲胎蛋白（AFP）水平在三个代谢表型之间也存在差异。表型Ⅲ中AFP水平较高（>400 g/L）的患者比例占80%，明显高于其他表型组，这与表型Ⅲ的不良预后结果相一致。本实验也评估了代谢表型的患者总生存率。结果发现代谢表型组可明显分级为低风险组（代谢表型Ⅰ和Ⅱ）和高风险组（代谢表型Ⅲ）（log-rank 检验，p= 0.004）（图4b），FFAs含量较高的代谢表型Ⅲ的临床预后最差（log-rank检验，p = 0.016）。

采用差异富集分数（DES）来量化和评估患者HCT和ANT样本中6种特征FFAs的差异，将验证数据集分为三组（低风险组Ⅰ和Ⅱ，高风险组Ⅲ）（如图5a）。在患者的总生存率评估中，结果显示高风险组Ⅲ的临床预后对比低风险组Ⅰ和Ⅱ相对较差(log-rank 检验，p=0.039)(图 5b)。同时观察到在发现数据集中，低风险组和高风险组之间的DES存在显著差异，组Ⅲ的DES明显高于组Ⅰ和组Ⅱ（p＜0.001；图4c），获得DES的受试者工作特征曲线（ROC）的曲线下面积（AUC）为0.979（图4d）。而在验证数据集中，DES在两个风险组之间也存在显著差异（p＜0.001）（图5c），高危患者的灵敏度和特异性分别为 63.6%和88.9%，AUC值为0.869（图5d）。基于上述验证结果，表明6种FFAs组成的代谢物分类器可对HCC患者进行预后分级，肿瘤组织中FFAs水平较高的患者预后相对较差。

图5  验证队列中HCC相关6种特征脂肪酸的聚类分析

本研究通过HCC患者肿瘤组织的非靶向代谢组学分析，阐明HCC的代谢重编程主要表现为糖酵解和脂肪酸合成的代谢途径被过度激活，三羧酸循环受到明显抑制，肿瘤通过自主改变代谢途径以满足增加的生物能量和生物合成需求，同时通过抑制氧化应激来减少细胞凋亡，揭示了肿瘤组织代谢特征与HCC预后存在关联。通过NMF聚类分析，发现6种特征游离脂肪酸可作为HCC预后风险分级分类器，可潜在评估预后不良患者，为HCC的临床个性化治疗及预后评估提供新的思路。

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